蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)
蜡样芽胞杆菌分布比较广泛，在土壤和植物上及许多食物上都能分离到。引起食物中毒的食品必须含有较大量的细菌，每克或每毫升食品中约需含107个以上的蜡样芽胞杆菌。
蜡样芽胞杆菌在食品上，于20度以上的环境中放置，能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由于本菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。
一、生物学特性
1．形态和染色特性
本菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端，芽胞较菌体小。
2．培养特性
1）需氧菌，生长温度范围在10C一45℃之间。最适生长温度为28—35℃。
2）对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，直径为4—6mm，菌落边缘往往呈扩散状，表面稍干燥。
3）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。在菌落周围初呈草绿色溶血，时间稍长即完全透明。
4）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。
3．生化特性
4．血清学特性
蜡样芽胞杆菌有两种抗原，一种是耐热的，一种是不耐热的。
5．抵抗力
蜡样芽胞杆菌生长型不耐热，100度 20分钟即可被杀死，对酸碱不敏感。pH6—11对本菌基本上不受影响，pH5以下，生长可受到抑制。．
二、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除了必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病毒素。
蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素有两种
1、耐热性肠毒素：100度30分钟不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。
2、不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种食物中形成。
三、临床症状
蜡样芽胞杆菌食物中毒，在临床上一般可分为呕吐型和腹泻型两类。
呕吐型中毒多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2—3小时，最短为30分钟，最长5—6小时；中毒症状：呕吐，腹痉挛，腹泻则少见，一般经过8—10小时而治愈。
腹泻型中毒由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6小时以上，一般为6—14小时；中毒症状：腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程24-36小时。
两型均少见体温升高，预后良好。
四、流行病学
1、季节性特点
以夏、秋季，尤其是6－10月为多见。
2、食品种类
包括乳及乳制品、肉类食品、蔬菜、米粉、米饭等。
3、食物中腊样芽孢杆菌的来源
肉及制品的带菌率为10－26％，乳及制品带菌率为23－77％，食品中该菌的污染源主要是泥土、尘埃、空气，其次是昆虫、苍蝇、不洁的用具等。如果食用前不加热或加热不彻底，即可引起食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒，是一种常见的食物中毒。第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的完整报告在1950年发表于挪威，随后许多国家，特别是北欧和东欧国家也报告有类似的食物中毒爆发。1971年以来英国也报告过多起蜡样芽胞杆菌食物中毒。我国于1973年南京市卫生防疫站，1974年鞍山市卫生防疫站相继报告蜡样芽胞杆菌食物中毒以来，近几年来又有一些单位报告了本菌引起的食物中毒。引起食物中毒的食品范围很广，包括肉类、菜汤、烧鸡、炒菜、鱼、牛奶、点心食品，剩饭等等。
中毒预防：蜡样芽胞杆菌在15℃以下不繁殖

摘  要：本文主要研究了蜡样芽孢杆菌在高温杀菌产品、生产用水及生产环境的污染状况。肉中所含有的蜡样芽孢杆菌的数量比蔬菜类产品高。余氯对水中蜡样芽孢杆菌有一定的控制作用。
关键词：高温杀菌；蜡样芽孢杆菌；污染；控制
高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制措施
蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。蜡样芽孢杆菌常在下列产品中存在，如乳、肉、蔬菜、甜点心、调味汁、凉拌菜、炒饭等。往往因不加热或加热不完全引起食物中毒。针对我公司对日出口高温杀菌产品中出现的腐败现象，经反复检测、试验，确定引起产品腐败变质的微生物为蜡样芽孢杆菌。本试验的目的为检测高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制措施。
1  材料方法
1.1  设备和材料
吸管、培养箱、均质器、天平、菌落计数器、冰箱、微波炉、平皿、滤器、抽滤设备、无齿镊子。
1.2  培养基及试剂
NGKG寒天基础培地、NaCl、95％酒精、鸡蛋。
2  检测方法［1，2］
2.1  水中蜡样芽孢杆菌的检测方法
2.1.1  原理
用孔径为0.45mm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上培养，计数滤膜上的典型蜡样芽孢杆菌菌落总数。
2.1.2  检验步骤
过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将1000ml水样（如水样含菌数较多可减少过滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门在-50kPa下抽滤。
培养：水样滤完后抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分移放在表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入恒温箱内，35℃培养48h。
结果观察：菌落特征为：35℃培养18h后，观察菌落，形成直径3～5mm，有的约10mm大而扁平、灰白色、粗糙的菌落。菌落表面粗糙似有毛玻璃状或溶蜡状，边缘呈扩展状。另外，在菌落周围因卵磷脂作用而形成明显的白至淡粉色的沉淀环。根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱不形成沉淀环的。即典型菌落应符合蜡样芽孢杆菌特征：中心菌落呈白色不规则状，即一般不呈光滑的圆形，不呈典型凸起状，而是扁平凸起；白色菌落外是淡粉色环；必须有卵黄反应（在集落周围形成因卵黄作用形成的明显的浑浊圈，根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱，形成浅浑浊环的东西）。
计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数。
2.2  产品和环境中蜡样芽孢杆菌的检测方法
2.2.1  原理
蜡样芽孢杆菌呈卵磷脂酶阳性，在卵黄培养基上形成菌落周围明显的沉淀环。另，本菌在多粘菌素B中呈自然耐性，利用这些特性，使用作为选择分离培养基的加卵黄的NGKG寒天培地。
2.2.2  实验操作
样品制备：以无菌操作称取25g样品于灭菌均质杯内，加入225ml灭菌0.85％盐水，均质拍打30s，制成1∶10的样品匀液。预想到菌落会多的情况，进行梯度稀释。
分离接种：用无菌吸管分别吸取各梯度稀释液0.1ml分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上。
培养：迅速以L行玻璃棒将接种物涂布于培地表面，避免涂到平板边缘，将平板正置，直至接种物被培养基吸收，将平板翻转，35℃培养48h。
菌落观察：同上。
计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数直径3～5mm，有时10mm的大扁平、灰白色、粗糙的集落。若吸取各梯度稀释液0.1m1分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，则每g (ml)食品中蜡样芽孢杆菌的总数=2个平板上的菌落数的算术平均值×相应的稀释倍数×10。
例：将检样10**-1稀释液各0.1ml涂布于2个NGKG寒天培地平板上，各生长蜡样芽孢菌20个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为：
[(20+20)／2]×10×10**1=2.0×103个／g
2.3  污染的检测
2.3.1  产品中蜡样芽孢杆菌的检测方法（如上）
2.3.2  水中蜡样芽孢杆菌的检测方法为滤膜法[1]  使用测余氯的方法为比色法[2]。目的是研究自来水中的游离余氯对蜡样芽孢杆菌的影响。
2.4  杀灭研究
蜡样芽孢杆菌耐热，其37℃16h的肉汤培养物的D80值为10~15min；使肉汤中细菌(2.4×107/ml )转为阴性需100℃20min。其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃60min才能杀死。蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18％的条件下仍能存活或生长。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。且蜡样芽孢杆菌喜农作物，一般以芽孢的形式存在于食品中，在适宜的条件下繁殖旺盛的革兰氏有芽孢杆菌。
杀灭：100℃经20min菌体可被杀死(未产芽孢)。
3  结果与讨论
3.l  产品检测结果与讨论
产品检测包括原料(含加工后的)和装袋后未杀菌半成品。结果见表1。
表1  产品检测结果

　　　   五花肉 猪脖精肉
　　   数量 824 66 75 472 106 211 526
　　   检出数量 93 5 7 25 4 56 0
　　   检出率％ 11.29 7.58 9.33 5.30 3.77 26.54 0.00
如表1中所示，肉包括五花肉、猪脖精肉；蔬菜中含有胡萝卜，总样品量为肉、蔬菜和半成品的总和。五花肉、猪脖精肉、胡萝卜(含漂烫后的原料)，其蜡样芽孢杆菌的检出率分别为7.58％，9.33％和3.77％，说明肉中所含有的蜡样芽孢杆菌的数量比较高，再根据肉类和蔬菜类的检出率相比，也同样验证了肉比蔬菜更容易繁殖蜡样芽孢杆菌。从原料到半成品，其检出率从8.51％和5.30％升到了半成品的26.54％，说明车间在从原料加工到半成品的过程中，蜡样芽孢杆菌是不断繁殖的。
3.2  水检测结果与讨论
食品加工车间的每一个工序几乎离不开水，而水是微生物生长繁殖的必备条件。车间用水来自周围山地，无污染，其水流通系统为：地下水—集成水塔—分支输送到车间；地下水经水泵抽到水塔内，加次氯酸钠消毒，然后输送到车间。根据水的流程模拟进行检测，其结果如下：
人工配制消毒水，按比例加次氯酸钠配制成消毒水，使用的水量为1L。对所配制的水放置一段时间以模仿水塔和水管终端水的余氯。试验如下：
(1)对所配制的水样放置0.5～1h后测余氯和蜡样杆菌结果见表2。
表2  水检测结果
水的余氯 放置0.5～1h后余氯 蜡样芽孢杆菌数
（ppm） (ppm) (个／L)
0.3 0.3 30
0.5 0.5 18
1.0 1.0 4
（2）对所配制的水样放置2h后测余氯和蜡样杆菌结果见表3。
表3  水样中的余氯和蜡样杆菌结果
水的余氯 放置2h后余氯 蜡样芽孢杆菌数
（ppm） (ppm) (个／L)
  0.45 0.3 24
0.5 0.3 22
1.0 0.9 3
（3）对所配制的水样放置３h后测余氯和蜡样杆菌结果见表４。
表4  水样中的余氯和蜡样杆菌结果
水的余氯 放置3h后余氯 蜡样芽孢杆菌数
（ppm） (ppm) (个／L)
0.5 0.4 8
0.8 0.5 4
1 0.6 3
1.5 1.0 1
2 1.5 0

（4）由以上的试验结果分析可知，在水中添加次氯酸钠可减少自来水中蜡样芽孢杆菌的数量，在自来水中游离氯越高蜡样杆菌数量则越少，且杀菌效果随时间长短有关系，我们拿0.5ppm和1.0ppm自来水中的细菌数量进行比较，其杀菌效果见表5。
　　表5  水中蜡样芽孢杆菌数量比较
新取自来水中蜡样芽
胞杆菌(个／L)
新配制水余氯(ppm) 放置0.5～1h后蜡样 放置2h后蜡样芽胞 放置3h后蜡样芽胞
  芽胞杆菌(个／L) 杆菌(个／L) 杆菌(个／L)
　 0.5ppm 18 22 8
　 杀菌效果 42％ 61％ 78％
1.０ppm 4 3 3
杀菌效果 87％ 94％ 92％
由表5可知，余氯的浓度越高，杀菌时间越长，杀菌效果越好，其百分率越大。余氯为1.０ppm时，杀菌时间为2h时，其杀菌百分率为94％，基本上把蜡样芽孢杆菌杀死了。所以车间用水一般要加氯杀菌(消毒水)。根据产品的要求和客户的要求，制定适合的余氯浓度，并经常检测余氯的浓度，使其达到要求，并定期更换消毒水，保持其最佳杀菌效果。
3.3  环境检测结果与讨论
车间加工环境污染情况见表6 。
表6  车间环境污染情况
名称 空气沉降 工人 电子秤 金探机切片机 案面 刀、刀板 盒盆 蒸柜 水槽、模具等               
数量  50 54 15 15 30 7 34 3 42
蜡样芽胞杆菌 10 7 5 l 2 2 4 l 0
检出率％ 2.00 12.96 33.33 6.67 6.67 28.57 11.76 33.33 0
由以上结果可知蜡样芽胞杆菌在车间环境中广泛存在，除了水槽、模具等中没有检出，其余各处都有检出。
3.４  工厂控制
（1）在车间加工的环境中，其空气也含有蜡样芽胞杆菌，对车间加强空气环境的控制，车间在班后应开臭氧机，进行臭氧杀菌；改善车间布局，减少与外界空气的对流。
（2）由于余氯对水中蜡样芽胞杆菌有一定的抑作用，可以在不影响产品质量的情况下，适当增加余氯量。◇

蜡样芽孢杆菌食物中毒：
蜡样芽孢杆菌主要存在于土壤、空气、尘埃、昆虫中。进食受到蜡样芽孢杆菌污染的剩米饭、剩菜、凉拌菜、奶、肉、豆制品即可导致食物中毒。呕吐型中毒一般在进食后1-5小时出现症状，主要有恶心、呕吐、腹痛。腹泻型中毒一般在进食后8-16小时出现症状，主要有腹痛、腹泻。预后较好。
预防措施：
（1）严格食品的采购关。禁止采购腐败变质、油脂酸败、霉变、生虫、污秽不洁、混有异物或者其他感官性状异常的食品以及未经兽医卫生检验或者检验不合格的肉类及其制品（包括病死牲畜肉）。
（2）注意食品的贮藏卫生，防止尘土、昆虫、鼠类等动物及其他不洁物污染食品。
（3）食堂从业人员每年必须进行健康检查。凡患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎等消化道疾病（包括病原携带者），活动性肺结核，化脓性或者渗出性皮肤病以及其他有碍食品卫生的疾病的，不得从事接触直接入口食品的工作。
（4）食堂从业人员有皮肤溃破、外伤、感染、腹泻症状等不要带病加工食品。
（5）食堂从业人员工作前、处理食品原料后、便后用肥皂及流动清水洗手。
（6）加工食品的工具、容器等要做到生熟分开。加工后的熟制品应当与食品原料或半成品分开存放，半成品应当与食品原料分开存放。
（7）加工食品必须做到烧熟熟透，需要熟制加工的大块食品，其中心温度不低于70℃。
（8）蜡样芽孢杆菌在15 oC以下不繁殖，剩饭剩菜应低温保藏。该菌污染的食品一般无腐败变质的异味，不易被察觉，因此，剩饭剩菜一定要在餐前彻底高温加热。
（9）带奶油的糕点及其他奶制品要低温保藏。
（10）储存食品要在5oC以下。若做到避光、断氧，效果更佳。生、熟食品分开储存。
蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。
3、临床症状
　　当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。
　　蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。
三、致病性
　　蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。
　　致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。

我国已成为世界上空调用户最多的国家，也是“空调病”发病率最高的国家。空调系统中微生物污染状况对室内环境影响较大，为此，我们对不同场所包括办公楼、旅馆及宾馆、商场、医院以及家庭的空调中微生物污染状况进行了检测。
    无论在何场所，中央空调、分体及柜式空调，均能检出细菌及霉菌；非中央空调过滤网与热交换器的细菌与霉菌污染明显高于中央空调。通过对空调系统中的菌谱分析可知，空调系统中主要是蜡样芽孢杆菌的污染，最高检出达到100％；其次是霉菌、金黄色葡萄球菌，平均检出水平在10％左右；军团菌主要在过滤网，平均检出水平在5％。蜡样芽孢杆菌是一种条件致病菌，主要会引起食物中毒。金黄色葡萄球菌是一种致病的葡萄球菌，主要引起局部破损皮肤的化脓性感染，也可引起深部组织的化脓性感染。部分霉菌的菌丝、孢子及其代谢物是导致人体过敏的因素。军团菌病是一种急性呼吸道传染病，病死率较高，该病流行于夏秋季，常见的感染来源为污染的空调和供水系统，尤以中央空调冷却循环水为最多。
    调查结果证实，在任何场所中，所有空调均不同程度地存在微生物污染，这些病原体对人体健康都有着较大的潜在危害。因为室内的温度适宜，病原体在空调机内大量繁殖，随空调气流的循环，被送到室内的每个角落，人长时间呆在空调室内，就会感到头晕、乏力、免疫力下降，严重者就会罹患呼吸道等疾病，即“空调病”。一些发达国家，如日本、西欧等国，他们的空调每年至少清洗消毒一次，而我国则在近两年刚刚开始。据我们了解，本市大多数市民对空调的清洗消毒尚未引起足够的重视，许多人误认为只要把过滤网罩清洗一下，就算洗过空调了。其实，清洗空调主要是洗热交换器（即蒸发器与冷凝器），最好由专业的技术人员、专用设备、专用空调清洗剂进行清洗。主要是用清洗剂先清除分解夹缝深处的污垢，再用清水清洗，最后消毒。只有这样，才能达到消灭病原体的目的，而且，清洗后的空调，制冷效果更佳。最终，既使室内温度适宜，又减少空气污染，保障了人体健康。
各种菌的杀灭条件

1   菌落总数  121℃15min
2  大肠菌群60℃经30分钟
3    空肠弯曲菌 60℃经30分钟
4    志贺氏菌  60℃经30分钟
5   霉菌     60度5—10分钟
6    酵母菌   60度10—15分钟
7     肠杆菌科   60℃经30分钟
8    单增李斯特菌     70℃持续2分钟以上
9    沙门氏菌 一般对热不稳定，60℃经15分钟或乙醇处理被破坏。
10   大肠杆菌  1、水中1ppb（10-9）氯可杀死此菌。2、在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。
11   金黄色葡萄球菌   1、加热80℃30min才能杀死，煮沸可迅速使他死亡。2、根据美国食品药品监督管理局(FDA)对冻肉中杀灭金葡菌的指南，未产生肠毒素的金葡菌在71°C，通过1分钟加热就可杀灭。
12    副溶血性弧菌   1、56℃30分钟死亡，75℃加热5分钟或90℃加热1分钟即可杀灭。2、对酸抵抗力较弱，在2﹪冰醋酸或食醋中立即死亡。
13   蜡样芽孢杆菌  100℃经20分钟即可杀灭，而芽孢能耐受100℃30分钟才能杀灭。
14  霍乱弧菌   1、湿热55℃，15分钟，100℃，1～2分钟，水中加0.5ppm氯15分钟可被杀死。2、0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒目的。3、在正常胃酸中仅生存4分钟。

蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的体外抑制研究

摘  要：本试验通过蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种及分别先后接种等3种不同的接种方式分别于4h、8h、12h、24h、36h、48h等6个时间点观察抑制效果，以确定最佳接种方式。研究表明，先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌，抑制作用最强；蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种次之；先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌，抑制作用最弱。并且每种接种方式都在12小时左右出现抑制高峰。
关键词：蜡样芽孢杆菌；大肠杆菌；体外抑制

蜡样芽孢杆菌做为一种有益菌，已经在生产中广泛使用，对维持肠道微生态起重要作用[1，2]。本实验通过蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的体外抑制研究，来确定蜡样芽孢杆菌的最佳接种时间，令其更好地发挥自己的最大潜能，更好地为人类的日常生活、生产服务。

材料与方法
1 材料
1.1 菌种
蜡样芽孢杆菌：由嘉应学院生物系实验室提供；大肠杆菌：从健康鸡的粪便中直接提取、分离[3]。
1.2 培养基
普通液体培养基；伊红美蓝琼脂培养基；麦康凯琼脂培养基。
2  实验方法
本试验采用的方法：液体培养基中抑制作用的测定[4]。
分别取蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌24小时培养物0.1ml，按下述三种不同的方法接种于10ml普通液体培养基中，37℃培养。并于接种后4、8、12、24、36、48小时取样，均匀涂抹在麦康凯培养基上，计数大肠杆菌的值。
A，同时接种蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌；B，先接种蜡样芽孢杆菌，37℃培养24小时后，接种大肠杆菌；C,先接种大肠杆菌，37℃培养24小时后，接种蜡样芽孢杆菌。
3 实验过程
将蜡样芽孢杆菌与大肠杆菌分别从斜面培养基接种于液体培养基中，充分混匀，置于37℃恒温振荡器中培养24小时。24小时以后，吸取蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌菌液各0.1ml接种于10ml液体培养基中；取蜡样芽孢杆菌菌液0.1ml培养24小时，再取大肠杆菌菌液0.1ml接入管中；取大肠杆菌菌液0.1ml培养24小时，再取蜡样芽孢杆菌菌液0.1ml接入管中。分别置于37℃摇床培养。本实验每个处理各取六个时间点进行计数，其中每个时间点各做两个平行样，大肠杆菌单独培养做为空白对照实验。
于接种后4、8、12、24、36、48小时等六个时间点分别取样，进行菌液稀释，各取0.1ml菌液加入0.9ml的无菌水中，制成10倍稀释菌液；再吸取10倍稀释菌液0.1ml加入0.9ml无菌水，制成100倍稀释菌液。按此操作，将菌液稀释为107、108、109倍的稀释菌液。取样后的试管液弃用，以防止菌液受污染。
然后吸取107、108、109倍稀释菌液各0.3ml加入麦康凯琼脂培养基上，用L棒轻轻涂抹均匀，并倒置放入37℃培养箱中培养24小时。最后，选择最佳稀释倍数的平板，本实验选择107倍稀释。计算大肠杆菌的菌落数，并取其对数值。
结果与分析
1  蜡样芽孢杆菌与大肠杆菌同时接种的体外抑制效果
蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种的抑制效果，见表1。

表1 蜡样芽孢杆菌在液体培养基中对大肠杆菌的体外抑制效果（lgCFU/ml）
（蜡样芽孢杆菌与大肠杆菌同时接种）
项目        4 h        8 h        12 h        24 h        36 h        48 h
实验组        9.57        9.72        9.27        9.72        9.87        9.87
对照组        9.57        9.77        9.92        10.07        10.08        9.93
处理显著性        NS        NS        **        *        *        NS
注：实验组表示蜡样芽孢杆菌与大肠杆菌混合培养；对照组表示大肠杆菌单独培养；处理显著性为实验组与对照组的比较，NS为差异不显著；*为P＜0.05，差异显著；**为P＜0.01，差异极显著。以下表格与之相同。

从表1可以看出：在蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种后的8小时内，实验组与对照组差异不显著（P＞0.05），4h时，实验组和对照组两点甚至重合，也就是说，在这段时间内，蜡样芽孢杆菌并没有对大肠杆菌产生抑制作用，或抑制作用较弱，不明显；在12h时，实验组与对照组出现了极显著差异（P＜0.01），这是蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌抑制作用的高峰期，并在24h、36h两个时间段保持差异显著的水平（P＜0.05）；在48h以后，实验组与对照组又表现为差异不显著（P＞0.05），说明蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制作用下降，并逐步消失。
2  先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌的体外抑制效果
先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌的抑制结果，见表2。

表2 蜡样芽孢杆菌在液体培养基中对大肠杆菌的体外抑制效果（lgCFU/ml）
（先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌）
项目        4 h        8 h        12 h        24 h        36 h        48 h
实验组        9.57        9.52        9.37        9.67        9.72        9.62
对照组        9.62        9.87        10.07        10.12        10.07        9.87
处理显著性        NS        *        **        *        *        *

从表2可以看出：在接种大肠杆菌后的4h时，结果与表1相同，实验组与对照组差异不显著（P＞0.05），但所不同的是，表2中，在8h时就出现了差异显著（P＜0.05），并在12h时出现差异极显著（P＜0.01），在以后的其它时间段中，都表现为差异显著（P＜0.05）。很明显，先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌的抑制作用更为持久一些，可见其抑制效果比同时接种的好。
3  先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌的抑制效果
先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌的抑制结果，见表3。

表3 蜡样芽孢杆菌在液体培养基中对大肠杆菌的体外抑制效果（lgCFU/ml）
（先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌）
项目        4 h        8 h        12 h        24 h        36 h        48 h
实验组        9.87        9.92        10.17        10.02        9.62        9.17
对照组        9.92        10.07        10.17        10.17        9.77        9.42
处理显著性        NS        NS        NS        NS        NS        *

从表3可以看出：其与表1和表2有明显不同，其在接种蜡样芽孢杆菌后的36h内，实验组与对照组都表现为差异不显著（P＞0.05），只有到48h才出现差异显著（P＜0.05）。此接种方式虽然效果没有前两种那么好，那么明显，但还是表现出一定的趋势和一定的抑制作用。
结论
综合以上结果，可以看出：①本实验中，蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌无论是同时接种还是先后接种，蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌都有明显的抑制作用。表明在健康动物肠道或体表，蜡样芽孢杆菌在维持微生态平衡、抵抗病原菌感染方面，具有重要的生态学意义。②蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌抑制作用的强弱与它们之间的接种方式、接种时间有密切关系。先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌，抑制作用最强；蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种次之；先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌，抑制作用最弱。这种结果与淳泽、何明清（1994）的结果基本一致。蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种后8h内，蜡样芽孢杆菌正处于生长、繁殖、代谢产物积累的阶段，其抑制作用还没产生或不明显，直到12h左右，由于代谢产物积累到一定水平，其抑制作用不断增强并达到最高值，随着时间的推移，其抑制作用逐渐减弱并消失；先接种蜡样芽孢杆菌，由于其先在液体培养基中产生菌体优势，当接种大肠杆菌后，已产生的蜡样芽孢杆菌代谢产物很快地对大肠杆菌进行抑制，从而使大肠杆菌数量很快就减少，所以我们可以见到，先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌的抑制作用比同时接种的抑制作用出现得早，而且强；同样的道理，先接种大肠杆菌，其在液体培养基中建立菌体优势，当接种蜡样芽孢杆菌后，蜡样芽孢杆菌很难对其产生抑制作用，使得这种接种方式的抑制作用最弱。以此可以推测蜡样芽孢杆菌在生产实践的使用中，应该以预防为主，并且出生后使用越早越好。③从表1、表2都可以看出，差异极显著（P＜0.01）都出现在12h，证明在12h左右蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的抑制作用最强，抑制效果最好，这可能是由蜡样芽孢杆菌的生理周期所决定的。